什麼是 ELISA?
酵素連結免疫吸附法 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)，又稱酵素免疫分析 (enzyme immunoassay, EIA)、酶聯法，是一種靈敏、特異且廣泛應用於生物學、生化學和醫學研究中的分子生物學分析技術。其原理為在固體表面 (如微孔盤) 上，利用抗原及抗體間的專一性鍵結，以酵素標記的抗體或抗原，以檢測樣品中的目標分子。而用以標記的酵素被稱為報導酵素，常見的有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)等。
ELISA 相較於其它的免疫分析技術具有更多優勢。首先，相較於其他免疫學檢測技術，ELISA具有更高的靈敏度和專一性，可以檢測非常低濃度的生物分子，如蛋白質、抗體和細胞因子等，並可區分相似的分子。這使得 ELISA 在診斷疾病、監測病情、檢測病原體等方面更加具有可信度和精確度。
操作上，ELISA 操作簡單、快速、容易自動化，可減少人工操作的誤差，提高實驗的穩定性和可重複性。而且，ELISA所需的樣品量很小，能夠節省寶貴的樣品。ELISA亦常應用於高通量 (high throughput) 檢測，同時檢測多種樣品，有效提高檢測效率、節省時間和成本。同時，由於 ELISA 是一種非放射性的檢測方法，不存在輻射危害，符合環保和人體健康的要求。基於以上優勢，ELISA 被廣泛應用於臨床診斷、生命科學研究等領域。
ELISA 依分析目的不同，可分為定性、定量及半定量生物分子
- 定性 (qualitative)：
用於確定樣品中是否存在特定的生物分子，例如病原體抗原、抗體等。通常使用單一抗體對樣品進行檢測，如果樣品中存在目標分子，就會產生信號；反之，則不會產生信號。 - 定量 (quantitative)：
用於測量樣品中目標分子的濃度，通常使用標準曲線法 (standard curve) 進行定量。在分析時，樣品的吸光值與標準曲線上的已知樣品濃度相對應，就可以計算出樣品中目標分子的濃度。 - 半定量 (semi-quantitative)：
是一種介於定性和定量之間的分析方法，通常用於測量樣品中目標分子的相對濃度。其是將樣品與已知濃度的標準物質進行比較，來估算樣品中目標分子的相對濃度。
操作ELISA的四種方法
依不同操作方法，ELISA 又可分為直接法 (Direct ELISA)、間接法 (Indirect ELISA)、三明治法 (Sandwich ELISA)、競爭法 (Competitive ELISA) 四種方法。
直接法 (Direct ELISA)
直接法通常用於檢測抗原，在過程中只需要使用到一種一級抗體 (primary antibody)，不需要複雜的步驟即可偵測分析物 (analyte)，為最簡單的 ELISA 方法。其操作方法是將目標抗原固定 (coating; immobilizing) 於固體表面 (solid phase) 上，一般使用 96 孔微孔盤 (96-well plate)，再使用酵素標記之一級抗體檢測待測抗原。 由於反應過程單純，直接法可以快速分析結果，且不會產生二級抗體 (secondary antibody) 的非專一性交互反應。然而，也因為只使用到一種抗體，直接法無法放大檢測信號 (signal amplification)、降低其偵測的靈敏度。此外，試驗中的一級抗體都必須用酵素標記，相當耗時、耗成本。
間接法 (Indirect ELISA)
間接法是一種使用一級抗體與酵素標記的二級抗體進行結合的檢測方法，通常用於檢測未知的一級抗體。其中，最常見的應用實例是用於檢測愛滋病毒 (human immunodeficiency virus, HIV)。
這個方法的步驟是先將已知抗原固定在固體表面上，加入檢體，再加入酵素標記的二級抗體(secondary antibody)，以偵測待測抗體。由於使用了兩種抗體，因此間接法具有較高的靈敏度，且可使用多種一級抗體，在應用上更具彈性。
然而，間接法中二級抗體間可能會發生交互作用，導致非專一性的信號產生，影響實驗結果的準確性。為了解決這個問題，可以在實驗過程中加入阻斷液 (blocking solution)，減少非專一性的交互作用。如此一來，間接法就能夠更準確地檢測待測抗體，並得到可靠的結果。
三明治法 (Sandwich ELISA)
三明治法是利用兩種抗體對檢體中的待測抗原進行兩次專一性辨認，因此具有高偵測靈敏度及高專一性。家用驗孕試紙即是三明治法的應用實例之一。不過，此方法中的待測抗原須為多價抗原，以便與兩種或以上的專一性抗體結合。 與直接法和間接法不同的是，三明治法是將捕捉抗體 (capture antibody) 固定在固體表面上，再加入檢體，捕捉抗體會抓住檢體中具有專一性的抗原，再與一級抗體及酵素標記二級抗體反應。由於這個高度辨識的過程，檢體不需要事先進行純化，而可直接進行實驗。 然而，需要注意的是，在使用此方法時必須選用特定的一級抗體及二級抗體。為了避免一級抗體跟二級抗體競爭與抗原結合的現象發生，必須確認一級抗體跟二級抗體具有不同的抗原表位 (epitopes, 即抗原上可與抗體結合的位置)，且必須驗證一級抗體跟二級抗體可進行專一性結合，並可同時作用。
競爭法 (Competitive ELISA)
競爭法，又稱為競爭抑制ELISA (inhibition ELISA)，是利用待測抗原與酵素標記的生物分子，競爭結合於固定在固體表面上的抗原或抗體。若待測抗原在檢體中濃度越高，就會與越多抗體結合，導致有酵素標記之抗體結合少，呈色反應訊號值亦越低，即待測抗原濃度與呈色反應成反比。一般多用於檢測半抗原 (hapten) 或小分子抗原。
| 直接法 | 間接法 | 三明治法 | 競爭法 | |
| 方法原理 | 將目標抗原固定 於固體表面上，利用酵素標記之一級抗體檢測待測抗原 | 將已知抗原固定於固體表面上，加入一級抗體 、再加入酵素標記的二級抗體 偵測待測抗體 | 兩種抗體對檢體中的抗原進行兩次專一性辨認 | 利用待測抗原與酵素標記的生物分子，競爭結合於固定在固體表面上的抗原或抗體 |
| 優點 | •分析快速 •不會有二級抗體的交互作用產生 |
•高靈敏度 •可使用多種一級抗體，彈性高 •成本低 |
•樣品不需純化 •高靈敏度 •高專一性 |
•樣品不需純化 •可檢測單一樣品中大部份的抗原 •變異性低 |
| 缺點 | •靈敏度低 •可能出現偽陽 或干擾 •須使用具專一性的一級抗體 •須以酵素標記一級抗體，費時、高成本 |
•二級抗體的交互作用 | •須使用特定的一級及二級抗體 •待測抗原必須是多價抗原 •分析耗時、成本高 |
•低專一性，不適用於稀釋樣品 |
| 適用目標物 | 抗原 | 抗體 | 大分子抗原 | 半抗原、小分子抗原 |
造成ELISA偽陽性、高背景值、無訊號的原因
ELISA常面臨結果不穩定的狀況，如偽陽性 (false positive)、高背景值 (high background)、無訊號或訊號太低 (no or low signal) 等。而造成偽陽性或高背景值的原因，部份是由於未結合的抗體、抗原或是雜質在各步驟間沒有被完全去除，從而導致背景信號或是非專一性的交互作用。
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ELISA的操作流程
為了降低偽陽性及高背景值的可能性，ELISA各步驟間必須進行「清洗」(wash)，藉由此步驟去除非專一性或親和力低的反應物干擾。清洗液通常為磷酸鹽PBS緩衝溶液或TBS緩衝液，並可添加適當濃度的界面活性劑，如0.01%~0.1% Tween-20或Triton X-100 以降低樣品中的非專一性結合 。
清洗的過程非常重要。一般而言，每個清洗步驟需以緩衝液清洗 2~5 次。若使用人工手動清洗，則需注意甩淨殘留反應液，並且於甩淨殘液後，盡快加入下一個步驟的反應液，以避免微孔盤過度乾燥，亦可運用工具例如微孔盤清洗機進行清洗，以加快清洗速度、避免交叉污染。
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人工手動清洗 |
微孔盤清洗機 |
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抽吸清洗液 |
微量吸管 (pipette)、甩乾 |
分注器 |
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分注清洗液 |
微量吸管、洗瓶 (wash bottle) |
分注器 |
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微孔盤放置 |
平放 |
平放、橫放 |
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減少液體殘留 |
手扶斜放，可減少殘留 |
使用可斜放的清洗機，可減少殘留 |
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高溫高壓滅菌 (Autoclavable) |
依分注產品不同 |
通常可以 |
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成本 |
低 |
需考量整套系統（包含真空幫浦等）所包含之成本 |
ELISA和PCR的差異是?
ELISA 及 PCR 都是分子生物學中常使用的分析技術，總的來說，兩者皆有其優缺點，因此需要依據具體的應用選擇要使用哪種技術。 以 2019 年造成全球疫情大流行的新冠肺炎 (COVID-19) 為例，ELISA 及 PCR 都可以用來檢測冠狀病毒 (coronavirus)，但應用上仍有些許差異。
| ELISA | PCR | |
| 原理 | 利用抗原、抗體間的專一性結合，並利用酵素催化產生呈色反應 | 放大 DNA 片段來檢測病原體或檢測目標基因 |
| 檢測目標物 | 蛋白質分子 | DNA |
| 靈敏度 | 較高 | 較低 |
| 專一性 | 較低 | 較高 |
| 時間 | 慢 | 快 |
| 成本 | 較便宜 | 較昂貴 |
| 用於檢測冠狀病毒(cornavirus)之應用差異比較 | ||
| 樣本 | 血清 | 唾液 |
| 分析目標物 | 抗體 | RNA 逆轉錄後的DNA |
| 應用 | 確認人體是否被病毒感染過 | 檢測病毒是否存在於人體體內 |
因此，在流行病學中，利用 ELISA 搭配 PCR 檢測病毒或其它生物子，如猴痘病毒 (Monkeypox virus, MPV)、漢他病毒 (Hantavirus)、諾羅病毒 (Norovirus) 等，可以達到更全面的檢測效果。
另一種技術，則是將 ELISA 與 PCR 結合，為 PCR-ELISA。此方法可以將固定於固體表面的 DNA，直接以 PCR 定量 DNA 產物。由於本篇主要探討 ELISA 之分析方法，本文將不針對 PCR-ELISA 進行討論。
ELISA常見應用：
- 臨床醫學：癌症、自體免疫疾病、傳染病等疾病的診斷
- 病毒檢測：冠狀病毒 (coronavirus, SARS-CoV-2)、愛滋病毒 (HIV)、西尼羅病毒 (West Nile Virus) 等
- 即時檢測：家用驗孕試劑
- 學術研究：DNA/RNA 定量、細胞信號傳遞、代謝途徑、基因表達和調控等
- 食品安全：食品過敏原
參考文獻：
- Advantages of ELISA Tests, BLOCK Scientific
- Application of PCR-ELISA in Molecular Diagnosis, 2014
- Comparative Evaluation of RUT, PCR and ELISA Tests for Detection of Infection with Cytotoxigenic H. pylori, 2016
- ELISA Applications / Applications of ELISA, ELISA ENCYCLOPEDIA
- ELISA: Results – Quantitative, Qualitative and Sensitivity, BIO-RAD
- Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics, British Journal of Hospital Medicine, 2016
